При Александре VI Церковное Государство распалось на целый ряд государств, управляемых папскими родственниками из рода Борджиа. Сын Александра VI, Чезаре Борджиа, вызывавший восхищение у Макиавелли, всячески старался преобразовать Церковное Государство в Королевство средней Италии, обосновавшись в своем герцогстве Романья. После его падения в 1504 году Венеция стремилась подчинить своей власти города на побережье Адриатического моря. Затем Юлий II в своей энергичной манере прибег к силе для восстановления и расширения Церковного Государства. Он завоевал Перуджу и Болонью, а затем, в союзе с Камбрейской Лигой (в которую входили также император Максимилиан I, король Франции Людовик XII и король Арагона Фердинанд Католический) заставил Венецию вернуть Равенну, Червию, Фаенцу и Римини. Однако затем, заключив мир с Венецией, Папа создал Священную Лигу для изгнания французов из Италии. Хотя в 1512 году французская армия одержала победу над войсками Лиги при Равенне, Юлий II достиг своей цели, благодаря, главным образом, швейцарским наемным войскам, которых Папа смог привлечь с помощью кардинала Шиннера. Когда Максимилиан Сфорца завоевал Миланское герцогство, Юлий II получил также Парму и Пьяченцу, которые были изъяты из герцогства и включены в Церковное Государство. Кроме того, Редджио и Модена, принадлежавшие герцогу Феррары, были также включены во владения Папы, однако его преемник, Лев X, вернул эти города герцогу в 1515 году. Ужасная катастрофа обрушилась на Рим в результате неуверенной политики Климента VII. Бесчинствующие войска Карла V Габсбурга напали на Церковное Государство, а 6 мая 1527 года прорвались в Рим и подвергли город такому разорению, какого он не испытывал со времен нашествия варваров. Разрушение столицы христианства, продолжавшееся восемь дней и известное в истории как Sacco di Roma, закрыло эру папства эпохи Возрождения. Папа пробыл за стенами Замка св. Ангела до 6 декабря. В 1529 году он заключил мир с императором в Барселоне и получил назад Церковное Государство. Заключение мира было подтверждено на Болонской конференции, где Карл V 24 апреля 1530 года получил от Климента VII императорскую корону. В последние годы понтификата Климента VII произошел конфликт с английским королем Генрихом VIII, поводом для которого стал отказ Климента VII признать недействительным его брак с Екатериной Арагонской. В результате этого Генрих провозгласил себя главой английской Церкви, положив тем самым начало расколу.

В этот период и позднее различные регионы на некоторое время отделялись Папами от Церковного Государства и передавались как отдельные княжества их родственникам. Папа Сикст IV из рода Ровере в 1474 году сделал Федериго Монтефельтро герцогом Урбино и женил своего племянника Джованни делла Ровере на дочери Федериго, Джованне. Их сын, Франческо Мария делла Ровере, вступил во владение герцогством Урбино в 1508 году, во время понтификата другого Папы из рода Ровере, Юлия II. Юлий II передал ему также Викариат Пезаро, который ранее на правах ленного владения принадлежал Малатесте, а с 1445 года – Сфорце. Лишь после того, как мужская линия рода Ровере угасла в 1631 году, Монтефельтро, Урбино и Пезаро были возвращены Церковному Государству. Папа Павел III в 1545 году даровал Парму и Пьяченцу как герцогства своему сыну Пьеру Луиджи Фарнезе (хотя Павел III, Алессандро Фарнезе, был назначен Папой Александром VI кардиналом и епископом сразу трех епархий возрасте 25 лет, он не имел духовного сана, став священником лишь в 45 лет). Даже когда род Фарнезе угас, герцогства были возвращены не Церковному Государству, но испанской ветви Бурбонов, а в конце концов – Сардинии в 1860 году. Феррара, принадлежавшая некогда Матильде Каносской как папский феод, в 1208 году была подчинена гвельфскому родуЭсте, а в 1471 году стала герцогством. Когда в 1597 году основная линия рода Эсте угасла, Феррара была возвращена Церковному Государству и осталась в нем (за исключением периода наполеоновской оккупации) до итальянской аннексии в 1860 году. Модена и Редджио в 1597 перешли во владение боковой линии рода Эсте как имперский феод. Таким образом, Церковное Государство, до того как разразилась Французская революция, охватывало, по существу, ту территорию, которая принадлежала ему во времена Карла Великого, не считая некоторых частей древнего герцогства Сполето, присоединившихся к нему на юге со времен Иннокентия III.

Молниеносные изменения произошли во время Французской революции и Наполеона. В 1791 году Французская национальная ассамблея провозгласила объединение Авиньона и Венессена с Францией, и Пий VI по Толентинскому трактату вынужден был уступить их, в то же время отдав легатства Феррару, Болонью и Романью Цизальпийской Республике. В феврале 1798 года генерал Бертье, посланный в Рим Наполеоном, включил остатки Церковного Государства в Римскую республику. Поскольку Папа не мог согласиться с этим, он был взят в плен и вывезен в Сиену, а затем в крепость Валансе на Роне, где вскоре и умер 29 августа 1799 года. Антиклерикально настроенные массы радовались, что папству и Церкви пришел конец, однако эта радость оказалась преждевременной. В 1800 году под защитой императора Франциска II кардиналы избрали Папу Пия VII в Венеции; однако его ожидали тяжелые испытания. Действительно, в 1801 году по милости Наполеона Пий VII получил назад Церковное Государство в границах Толентинского мира. Однако положение Церковного Государства оставалось крайне ненадежным. В 1806 году Наполеон передал Беневенто Талейрану, а Понтекорво – маршалу Бернадоту. В 1808 году, после того как Пий VII не пожелал закрыть свои порты для англичан, Церковное Государство было вновь оккупировано, а в 1809 – полностью конфисковано. Марке, Урбино, Камерино и Мачерата были присоединены к только что созданному Королевству Италии, а оставшаяся часть Церковного Государства – к Франции. Церковное Государство было восстановлено лишь на Венском Конгрессе в 1815 году (где Папу представлял кардинал Эрколе Консальви) почти в старых границах, за исключением Авиньона и Венессена, которые не были возвращены Папе, а Австрия получила узкую полосу вдоль границы Феррарского региона к северу от По и право на размещение войск в Ферраре и Коммачио.